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酵母RNA提取試劑盒( DNase I )說明書
點(diǎn)擊次數(shù):1671 更新時(shí)間:2021-11-29

  

 

酵母RNA提取試劑盒( DNase I )說明書

 

                                                                                           

RNApure Yeast Kit ( DNase I )

 

Cat. No.   K0629

保存:Lyticase、DNase I、10×Reaction Buffer-20

       其它組分:室溫

 

組分說明

 

                                            Catalog no.             K0629

                                              Kit Size                 50

                                              DNase I                1000 U

                                        10×Reaction Buffer           1000  μl

                                             Buffer RL               35 ml

                                            Buffer RW1               40 ml

                                    Buffer RW2concentrate)          11 ml

                                        RNase-Free Water             10 ml

                                      Lyticase Working Buffer        30 ml

                                              Lyticase               300  μl

                                         Spin Column RM                50

                                    Collection Tube1.5 ml)            50

                                     Collection Tube2 ml)             50

 

產(chǎn)品簡介

 

    本試劑盒用于常見的各種真菌的總 RNA 的快速提取。既可以提取液體培養(yǎng)物,也可以直接提取固體培養(yǎng)基上的真菌菌落。操作簡單快捷,單個(gè)樣本 30 分鐘內(nèi)可以完成提取全過程,所提 RNA 純度高,OD260/280一般都在 2.0 左右。提取的 RNA

適用于 RT-PCR、Real-time RT-PCR、Northern Blot 、cDNA 合成等實(shí)驗(yàn)。

 

注意事項(xiàng)

1.  預(yù)防RNase污染,應(yīng)注意以下幾方面:

1)  使用無RNase的塑料制品和槍頭,避免交叉污染。

2) 玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時(shí),塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘,用水*沖洗后高壓滅菌。

3)  配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。

4)  操作人員戴一次性口罩和手套,實(shí)驗(yàn)過程中要勤換手套。

2.  樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融,否則會(huì)影響RNA提取的的量和質(zhì)量。對(duì)于有些細(xì)胞壁較厚以及在培養(yǎng)階段會(huì)產(chǎn)生大量代謝物的酵母,最好在生長的早期就收集樣品。

3.  使用前請(qǐng)檢查Buffer RL是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀,可置于56℃水浴重新溶解。Buffer RL在使用前請(qǐng)加入β-巰基乙醇,至終濃度為1%。如1 ml Buffer RL10  μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的Buffer RL室溫可保存1個(gè)月。

4.  Lyticase Working Buffer在使用之前應(yīng)加入β-巰基乙醇,1 mlLyticase Working Buffer加入10  μl的β-巰基乙醇,加入β-巰基乙醇的Lyticase Working Buffer可以在室溫下儲(chǔ)存1個(gè)月。

5.  第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在Buffer RW2中加入無水乙醇。  

自備試劑:β-巰基乙醇、無水乙醇(新開封或提取RNA專用)、70%乙醇(用無RNase的水配制)

操作步驟

 

1.   取約1-5 ml  酵母培養(yǎng)物,12,000 rpm~13,400×g)離心1分鐘,盡量吸取全部上清(菌液較多時(shí)可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中)。

     注意:酵母培養(yǎng)物最多不超過3×107個(gè)細(xì)胞,一般對(duì)于釀酒酵母OD600值為1.0時(shí),相當(dāng)于1-2×107細(xì)胞/ml。

2.                                                                                                                                                        酵母細(xì)胞壁的去除:向菌體中加入600  μl Lyticase Working Buffer(使用前檢查是否加入β-巰基乙醇,使其終濃度為1%,并加入5μl Lyticase10 U/μl),充分混勻,并在搖床上220 rpm/min30℃處理30分鐘。4,000 rpm~1,500×g)離心10分鐘,棄上清,收集沉淀。

 

     注意:以上為3×107 個(gè)酵母細(xì)胞Lyticase用量,根據(jù)酵母的菌株和酵母細(xì)胞數(shù)量的不同,所用的Lyticase的濃度和孵育時(shí)間應(yīng)該進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

3.   向沉淀中加入350  μl Buffer RL(使用前加入終濃度為1%的β-巰基乙醇)反復(fù)吹打幾次,使其充分裂解。如果有可見不溶物,最大轉(zhuǎn)速離心2分鐘,取上清進(jìn)行下一步。

 

     注意:盡量使細(xì)胞充分懸浮并充分裂解否則影響RNA產(chǎn)量。

 

4.   向步驟3所得到的溶液中加入1倍體積(350  μl)的70%乙醇(RNase-Free Water配制),混勻。

5.   將步驟 4 所得溶液全部加入到已裝入收集管(Collection Tube 2ml)的吸附柱(Spin Column RM)中,若一次不能加完溶液,可分多次轉(zhuǎn)入。12,000 rpm 離心 15 秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

     注意:若一次不能將全部溶液加入吸附柱中,請(qǐng)分兩次轉(zhuǎn)入。

6.   向吸附柱中加入 350 μl Buffer RW1,10,000 rpm 離心 1 分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

7.  配制 DNase I 混合液:取 52 μl RNase-Free Water,向其中加入 8  μl 10 × Reation Buffer 20  μl DNase I1U/μl),混勻,  配制成終體積為 80 μl 的反應(yīng)液。

 

8.   向吸附柱中直接加入 80 µl DNase I 混合液,20-30℃孵育 15 分鐘。

 

9.   向吸附柱中加入 350 μl Buffer RW1, 12,000 rpm 離心 15 秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

 

10.  向吸附柱中加入 500 μl Buffer RW2(使用前檢查是否加入無水乙醇),12,000 rpm 離心 15 秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

 

11.  重復(fù)步驟 10。

12.  12,000 rpm 離心 2 分鐘,倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘,以*晾干。

 

     注意:這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除,乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR  等)。

 

13.  將吸附柱置于一個(gè)新的無    RNase 離心管(Collection   Tube  1.5  ml),向吸附柱的中間部位懸空加入  30-50  μl RNase-Free Water,室溫放置 1 分鐘,12,000 rpm 離心 1 分鐘,收集 RNA 溶液,-70℃保存。

 

注意:1RNase-Free Water 體積不應(yīng)小于 30 μl,體積過小影響回收率。

 

      2)如果要提高 RNA 的產(chǎn)量,可用 30-50 μl 新的 RNase-Free Water 重復(fù)步驟 10

 

      3)如果要提高 RNA 濃度,可將得到的溶液重新加入到吸附柱中,重復(fù)步驟 10。


2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)外包及論文潤色服務(wù),協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤色,是客戶您值得信賴的科研合作伙伴!

如果您受時(shí)間、試驗(yàn)條件等限制而無法完成您的課題研究,歡迎您與我們聯(lián)系。

 

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

 


滬公網(wǎng)安備 31011802001676號(hào)

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