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β-興奮類快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的β-興奮類藥物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗β-興奮類藥抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含β-興奮類藥物的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)β-興奮類藥物的含量。
二、試劑盒特性
- 試劑盒靈敏度： 0.1ppb
- 孵育溫度： 25℃
- 孵育時間： 30min～15min
- 樣本檢測下限
豬 尿 ·········································· 0.3ppb
豬 肉 ·········································· 0.6ppb
- 交叉反應(yīng)率
克倫特羅（Clenbuterol）························· 100%
西馬特羅（Cimaterol） ······················· <4%
溴布特羅（Brombuterol） ······················ 60%
馬布特羅（Mabuterol） ························· 108%
班布特羅（Bambuterol） ······················ <5%
氯丙那林（Clorprenaline） ····················· <1%
沙丁胺醇（Salbutamol） ························· 75%
特布他林（Terbutaline ） ······················ 25%
噴布特羅（Penbutolol） ························· 19%
妥布特羅（Tulobuterol） ························ 23%
菲諾特羅（Fenoterol） ····························<0.1%
萊克多巴胺（Ractopamine） ······················ <0.1%
- 樣本回收率
豬 尿、豬 肉 ···························· 90%±30%
三、試劑盒組成
1 | 微量測試孔 | 每條8孔，一板12條 | |
2 | 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶 （1ml/瓶） | 0ppb | 0.1ppb |
0.3ppb | 0.9ppb | ||
2.7ppb | 8.1ppb | ||
3 | 酶標(biāo)記物 | 7ml | 紅色帽 |
4 | 抗體工作液 | 10ml | 藍色帽 |
5 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 |
6 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 |
7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
8 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
9 | 5X樣本提取液 | 50ml | 透明帽 |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標(biāo)儀、離心機、恒溫箱、打印機
微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl
試 劑：氫氧化鈉、濃鹽酸
五、樣本前處理步驟
- 樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
- 樣本前處理需配制：
配液1 0.2M 鹽酸
取 17.2ml 濃鹽酸加去離子水定容至 1L。
配液2 1M 氫氧化鈉
稱取4g 氫氧化鈉固體加去離子水定溶至
100ml。
配液3 樣本提取液
5X樣本提取液用去離子水1：4稀釋。
- 樣本處理：
（a）豬肉樣本的處理方法
- 稱取 2 ± 0.05g 均質(zhì)后的組織于50ml離心管中，加入3ml 0.2M鹽酸（見配液1），充分振蕩3min。
- 再加入600ul 1M 氫氧化鈉（見配液2）溶液和2.4ml 樣本提取液（見配液3）溶液，充分振蕩3min，室溫4000r/min 以上離心10min。
- 取20 µl上層液體用于分析。（注：離心后若有脂肪層，去除脂肪層或撥開脂肪層，取清澈液體進行分析）。
樣本稀釋倍數(shù)： 4倍
（b）豬尿樣本的處理方法
取20µl清亮尿樣直接測定（如果尿樣渾濁一定
要過濾或4000r/min離心10min，直至得到清亮
尿樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。
樣本稀釋倍數(shù): 1倍
六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
- 測定前應(yīng)須知：
- 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
- 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
- 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
- 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
- 操作步驟：
- 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
- 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。
- 配液：將 40ml濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
- 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
- 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20µl/孔到各自的微孔中，加入酶標(biāo)記物50µl/孔，然后加入80µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。
- 將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
- 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
- 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含β-興奮量成負相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.1ppb為1.816；0.3ppb為1.415；0.9ppb為0.74；2.7ppb為0.313；8.1ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb～8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中β-興奮類藥物實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ | B | ×100% |
B0 |
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以β-興奮標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中β-興奮類藥物實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（ 索取）
八、 注意事項
- 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
- 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
- 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
- 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
- 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
- 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
- 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。
- 該試劑盒理想反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
- 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
- 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。
